Останнім часом для генетичної трансформації рослин дослідники випробовують різні підходи. Одним з нетрадиційних підходів для здійснення переносу агробактеріальної Т-ДНК в однодольні рослини є метод Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta, який дозволяє уникнути культивування in vitro і сомаклональної мінливості. Цей спосіб сьогодні успішно використовується для генетичної трансформації різних сільськогосподарських культур, в тому числі і пшениці.

Метою роботи було проведення Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta м'якої пшениці з використанням штаму AGLO, що містить векторну конструкцію pBi2E або pBi-OAT з генами метаболізму проліну.

Об'єктом дослідження служили рослини м'якої пшениці високоврожайного сорту Зимоярка. Трансформацію проводили з використанням двох векторних конструкцій. Перша конструкція містить бінарний вектор pBi2E з цільовим геном – дволанцюговим РНК-супресором проліндегідрогенази, отриманим на основі гена Arabidopsis (ds-RNA suppressor ProDH1), а також селективний ген неоміцинфосфотрансферази ІІ (nptІІ) E. coli. Друга конструкція містить бінарний вектор pBi-ОАТ з цільовим геном – орнітинамінотрансферази арабідопсиса, а також селективний ген неоміцинфосфотрансферази ІІ (nptІІ) E. coli.

Суспензію клітин A. tumefaciens оптичною щільністю OD₆₆₀ = 0,5 і додаванням 100 мкM ацетосірінгона наносили на приймочку маточок за допомогою автоматичного піпет-дозатора. Після повного висихання суспензії проводили контрольоване запилення пилком, який був отриманий з інтактного колоса тієї ж рослини.

За трансформації in planta векторною конструкцією з pBi2E було отримано 424 насінини Т₀, а за трансформації векторною конструкцією з pBi-OAT – 411. Все отримане насіння пророщували на селективному середовищі і відбирали канаміцин-стійкі форми. При використанні pBi2E отримали 16, а при трансформації pBi-OAT – 11 рослин, стійких до канаміцину. Стійкі форми вирощували до повної стиглості зерна і отримання насіння Т₁. Все отримане насіння Т₁ аналізували за допомогою ПЛР. Серед 261 проаналізованих насінин Т₁, з конструкцією pBi2E тільки у 37 підтверджено присутність гена nptII. Додатково всі зразки, в яких підтверджена наявність гена nptII, перевіряли на присутність гена pdh за наявністю екзона 1. Результат аналізу показав, що зазначений ген присутній тільки у чотирьох рослин. Серед 129 насінин Т₁, отриманих з використанням конструкції pBi-OAT, у 46 підтверджено присутність гена nptII. Всі зразки, у яких підтверджено наявність гена nptII, перевіряли на присутність гена OAT. Результат аналізу показав, що зазначений ген присутній тільки у 7 рослин.

Таким чином, нами експериментально доведена можливість генетичної трансформації м'якої пшениці з використанням штаму AGLO, що містить плазміду рВi2Е з дволанцюговим РНК-супрессором гена проліндегідрогенази або pBi-OAT з геном орнітинамінотрансферази методом Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta. Наявність трансгенів підтверджено методом ПЛР аналізу. Частота трансформації з повним вбудовуванням генетичної конструкції становить 1,53 %, при використанні векторної конструкції рВi2Е і 5,43 % при використанні векторної конструкції рВі-ОАТ. Аналіз зразків на присутність гена вірулентності (VirC) дозволив виключити бактеріальну контамінацію рослинного матеріалу.